QF-PCR ile Anöploidi Analizi

Kantitatif Floresan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QF-PCR), prenatal tanı süreçlerinde yaygın olarak kullanılan, hızlı ve güvenilir bir moleküler tekniktir. Bu yöntem, özellikle en sık görülen sayısal kromozomal anomalilerin (anöploidilerin) saptanmasında etkinlik göstermektedir. Anöploidi, hücrede normalden farklı sayıda kromozom bulunması durumudur ve genellikle gelişimsel bozukluklara, düşük riskine ya da doğumsal sendromlara yol açabilir. QF-PCR tekniği, özellikle Trizomi 13 (Patau sendromu), Trizomi 18 (Edwards sendromu), Trizomi 21 (Down sendromu), cinsiyet kromozomu anöploidileri (Turner ve Klinefelter sendromları gibi) gibi durumların tanısında kullanılmaktadır.

QF-PCR Tekniğinin Prensibi

QF-PCR, hedef kromozomlara özgü kısa tekrar dizileri olan mikrosatellit bölgelerini (STR – Short Tandem Repeat) amplifiye ederek çalışır. Bu diziler, bireyden bireye farklılık gösteren, yüksek polimorfizme sahip DNA sekanslarıdır. STR bölgelerinin floresan ile işaretlenmiş primerler kullanılarak çoğaltılması ve kapiler elektroforez ile ayrılması sayesinde, kromozomların kopya sayısı kantitatif olarak belirlenebilir.

Normal bir bireyde her kromozomdan iki kopya bulunur. Bu durumda STR bölgeleri ya iki farklı alel (heterozigot bireylerde) ya da tek bir alel (homozigot bireylerde) şeklinde gözlemlenir. Ancak anöploidi durumunda örneğin Trizomi 21’de, aynı STR lokusunda üç farklı alel (tri-allelik) ya da bir alelin iki kat fazla (bir alel iki kez tekrar eden – 2:1 oranı) olduğu paternler izlenebilir. Bu sayede kromozom sayısındaki artış veya azalma kantitatif olarak tespit edilebilir.

Yöntemin Uygulama Aşamaları

1. DNA İzolasyonu: QF-PCR analizinde kullanılacak DNA, genellikle amniyotik sıvı, koryon villus örneği (CVS) ya da fetal kandan izole edilir. İzolasyon işlemi ticari kitler veya klasik yöntemlerle gerçekleştirilebilir.
2. PCR Aşaması: Hedef kromozomlara özgü STR bölgelerini çoğaltmak için floresanla işaretlenmiş spesifik primerler kullanılır. Bu aşama klasik PCR prensiplerine dayanır ancak kantitatif analiz yapılacağı için reaksiyon koşulları özenle optimize edilir.
3. Kapiler Elektroforez: PCR ürünleri, genetik analizör adı verilen cihazlarda kapiler elektroforez ile ayrıştırılır. Bu sistem, her STR bölgesinin floresan sinyallerini algılar ve pikler halinde grafik olarak sunar.
4. Veri Analizi: Elde edilen elektroferogramlar, kromozomal paternleri ortaya koyar. Normal disomiye karşılık gelen 1:1 paternin dışında 1:2 ya da 2:1 oranları, trizomi şüphesini destekler. Veriler, referans kontrol örnekleriyle birlikte değerlendirilir.

Avantajları

• Hızlı Sonuç Verme: Geleneksel sitogenetik analizler 7-14 gün sürerken, QF-PCR sonuçları 24-48 saat içinde alınabilir.
• Yüksek Güvenilirlik: Spesifik STR bölgelerinin kullanılması sayesinde yanlış pozitiflik riski düşüktür.
• Otomasyona Uygunluk: Kapiler elektroforez cihazları ile analiz süreci kolaylıkla otomatik hale getirilebilir.
• Kontaminasyon Riski Düşüktür: Kapalı tüp sistemlerinde çalışıldığından çevresel DNA kontaminasyonu minimaldir.

Sınırlılıkları

• Yalnızca Sayısal Anomalilerde Etkilidir: QF-PCR, yapısal kromozom anomalilerini (örneğin delesyon, duplikasyon, translokasyon) saptayamaz.
• Analiz Edilen Kromozomlarla Sınırlıdır: Genellikle kromozom 13, 18, 21, X ve Y analizine odaklanır. Diğer kromozomlardaki anöploidiler tespit edilemez.
• STR Polimorfizmine Bağımlılık: STR bölgeleri homozigot ise bilgi vericiliği düşer; bu durumda farklı STR lokusları eklenmelidir.

Klinik Kullanım Alanları

• Prenatal Tanı: QF-PCR, invaziv prenatal testler sonrasında hızlı ön tanı amacıyla kullanılır. Özellikle yüksek riskli tarama testleri sonrasında fetal anöploidi taraması için uygundur.
• Spontan Düşüklerde Analiz: Düşük materyalinde kromozomal anormalliklerin saptanması, tekrarlayan gebelik kayıplarının nedeninin belirlenmesine yardımcı olabilir.
• Yeni Doğanlarda: Dismorfik bulgular ya da mental gelişim geriliği gibi durumlarda hızlı kromozom analizine ihtiyaç duyulduğunda kullanılabilir.

Sonuç

QF-PCR, modern moleküler genetik tanı laboratuvarlarının önemli araçlarından biri haline gelmiştir. Özellikle prenatal dönemde hızlı ve güvenilir sonuç vermesi, invaziv girişimlerin ardından ailelere zamanında genetik danışmanlık sunulmasını mümkün kılmaktadır. Ancak, sınırlılıklarının farkında olunarak ve gerektiğinde klasik sitogenetik ya da daha kapsamlı genomik analizlerle desteklenerek kullanılması gerekir. Klinik tanı süreçlerinde, QF-PCR sonuçlarının yorumlanması mutlaka deneyimli genetik uzmanları tarafından yapılmalı, etik ilkeler ve hasta onamı göz önünde bulundurulmalıdır.